免疫印迹（WB）检测（磷酸化蛋白）

Western Blot基于SDS-PAGE电泳分离蛋白和抗原-抗体特异性结合两大核心原理：

电泳分离：SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大小迁移。

转膜：将凝胶中的蛋白条带转移到固相膜（如PVDF或NC膜）上，便于后续抗体结合。

抗体检测：一抗特异性结合目标蛋白，二抗（偶联酶或荧光基团）结合一抗，通过底物显色或化学发光检测信号。

详细实验步骤

1. 样本制备

关键点：保持蛋白完整性，避免降解！

• 细胞样本：

  1) 细胞裂解：使用预冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟。

  2) 离心：4℃、12000×g离心15分钟，取上清。

• 组织样本：

  1) 液氮研磨组织至粉末，加入裂解液匀浆。

  2) 同上离心取上清。

• 定量：BCA法测定蛋白浓度，调整至统一浓度（如2μg/μL）。

• 变性：加入5×SDS上样缓冲液，95℃煮样5-10分钟，-20℃保存备用。

⚠️ 注意事项：

• 全程冰上操作，防止蛋白降解！

• 裂解液需新鲜加入蛋白酶抑制剂（如PMSF）。

2. 配胶（SDS-PAGE凝胶制备）

关键点：根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度（参考下表）：

操作步骤：

1) 分离胶配制（以10%为例）：

• 蒸馏水 4.0 mL

• 30%丙烯酰胺 3.3 mL

• 1.5M Tris-HCl (pH8.8) 2.5 mL

• 10% SDS 0.1 mL

• 10% APS 0.1 mL

• TEMED 0.004 mL

• 混匀后迅速灌胶至距梳齿1cm处，覆盖异丙醇或ddH₂O压平胶面。

2) 浓缩胶配制（5%）：

• 蒸馏水 2.7 mL

• 30%丙烯酰胺 0.67 mL

• 1.0M Tris-HCl (pH6.8) 0.5 mL

• 10% SDS 0.04 mL

• 10% APS 0.04 mL

• TEMED 0.004 mL

• 混匀后灌胶，插入梳子。

⚠️ 注意事项：

• 丙烯酰胺有神经毒性，戴手套操作！

• APS和TEMED需现用现加，促进聚合。

3. 上样与电泳

操作步骤：

1) 将凝胶装入电泳槽，加入电泳缓冲液（1×Tris-Glycine-SDS）。

2) 每孔上样10-30μg蛋白（根据目标丰度调整），留一孔加预染蛋白Marker。

3) 电泳条件：

• 浓缩胶阶段：80V恒压，约20分钟（溴酚蓝跑出浓缩胶）。

• 分离胶阶段：120V恒压，至溴酚蓝到达胶底部（约1-1.5小时）。

⚠️ 注意事项：

• 上样前需离心样本去除气泡。

• 电泳缓冲液可重复使用3-4次。

4. 转膜（湿转法为例）

关键点：确保蛋白高效转移至膜上！

操作步骤：

1) 裁剪PVDF膜和滤纸至凝胶大小，PVDF膜需提前用甲醇激活15秒。

2) 组装转膜“三明治”结构（从负极到正极）：

海绵垫 → 滤纸 → 凝胶 → PVDF膜 → 滤纸 → 海绵垫

3) 转膜条件：

恒流200-300mA，转膜时间根据蛋白分子量调整（100 kDa以下：1小时；100 kDa以上：1.5-2小时）。

4) 转膜后，用丽春红染色观察转膜效果（可选）。

⚠️ 注意事项：

• 转膜全程在冰浴中进行，防止过热导致蛋白变性。

• 膜与凝胶间避免气泡（可用滚轮赶出气泡）。

5. 封闭

目的：减少非特异性结合。

操作步骤：

1) 将膜浸入5%脱脂牛奶（TBST配制），室温摇床封闭1小时。

2) 封闭后，TBST洗膜3次，每次5分钟。

⚠️ 注意事项：

• 磷酸化蛋白检测建议使用5% BSA封闭。

• 封闭时间过长可能导致信号减弱。

6. 一抗孵育

操作步骤：

1) 一抗稀释：按说明书比例（通常1:1000）用封闭液稀释。

2) 将膜与一抗溶液置于4℃孵育过夜（或室温2小时）。

3) TBST洗膜3次，每次10分钟。

⚠️ 注意事项：

• 一抗可回收保存（-20℃），重复使用3-5次。

• 磷酸化抗体需4℃孵育过夜以提高灵敏度。

7. 二抗孵育

操作步骤：

1) HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗稀释（通常1:5000-1:10000），用封闭液配制。

2) 室温摇床孵育1小时。

3) TBST洗膜3次，每次10分钟。

⚠️ 注意事项：

• 二抗需根据一抗种属选择（如兔源一抗对应抗兔二抗）。

• 避免长时间曝光导致背景过高。

8. 显影与结果分析

操作步骤：

1) ECL化学发光法：

• 将ECL A液和B液等体积混合，均匀滴加在膜上。

• 暗室中曝光X光胶片，或使用化学发光成像仪采集信号。

2) 结果分析：

• 使用ImageJ软件定量条带灰度值。

• 内参蛋白（如β-actin、GAPDH）校正目标蛋白表达量。

⚠️ 注意事项：

• 显影液需现用现配，避免失效。

• 多次曝光调整曝光时间（5秒-10分钟）。