小动物活体成像丨核心技术原理与高频问题全解析
小动物活体成像（In Vivo Imaging）是指在不牺牲实验动物的前提下，利用特定的成像技术和设备，对活体动物体内的生物学过程（如细胞活动、基因表达、疾病发展、药物分布与疗效等）进行可视化、定量化研究的技术。
- 多功能小动物活体成像系统
其核心原理通常涉及两个步骤：
标记（Labeling）：通过特定方式对研究对象（如细胞、基因、分子探针、特定组织）进行标记，使其能够被成像设备检测到。
成像（Imaging）：利用专门的成像仪器捕捉标记物发出的信号，将其转化为可视化的图像或定量数据。
根据标记方式和成像原理的不同，小动物活体成像主要分为以下几种类型：
1. 生物发光成像 (Bioluminescence Imaging, BLI)
原理：利用基因工程手段，将荧光素酶（Luciferase）基因导入目标细胞或与目标基因表达调控元件（如启动子）相连。当这些细胞在活体动物内表达荧光素酶蛋白后，向其体内注射相应的酶底物（如D-荧光素）。荧光素酶催化底物发生生物化学反应，将化学能转化为光能，产生近红外光或可见光（通常波长在400-700 nm）。该发光过程发生在生物体内，无需外部光源激发。成像设备（如高灵敏度CCD相机）在暗室内捕捉这些微弱的光信号，通过软件处理形成图像。发光强度通常与标记细胞的数目或目标基因的表达水平成正比。
特点：背景极低（无自发荧光）、灵敏度高、操作相对简单、适合长时间纵向研究。但需要基因转染，且信号强度相对较弱。
2. 荧光成像 (Fluorescence Imaging, FLI)
原理：利用荧光基团作为标记物。这些荧光基团可以是：
荧光报告基因（如GFP绿色荧光蛋白、RFP红色荧光蛋白及其衍生变体）表达的荧光蛋白。
荧光染料（Cyanine dyes如Cy5.5, Cy7， ICG等）。
荧光标记的抗体、纳米颗粒或小分子探针。成像时，需要外部光源（通常是特定波长的激光或LED）激发这些荧光基团。荧光基团吸收光能后跃迁到激发态，随后释放能量回到基态，发射出波长比激发光更长的荧光。成像设备探测并收集这些发射出的荧光信号形成图像。
特点：信号较强、有多种标记物可选、可进行多光谱成像、可结合靶向探针。但存在组织自发荧光背景干扰，穿透深度有限（尤其在可见光波段），激发光可能对生物组织产生光毒性或光漂白效应。
3. X光成像 (X-ray Imaging)
原理：基于X射线穿透物质时发生的衰减原理。不同密度的组织（如骨骼、软组织、肺部气体）对X射线的吸收能力不同。高密度组织（如骨骼）吸收更多X射线，低密度组织（如脂肪、肺）吸收较少。当X射线束穿过动物身体后，未被吸收的X射线投射到探测器（如平板探测器或胶片）上，形成反映组织密度差异的投影图像（如X光平片）。在计算机断层扫描（Micro-CT）中，动物在旋转平台上接受多角度X射线投影，计算机重建出横断面图像或三维结构图像。
特点：提供高分辨率的解剖结构信息，特别擅长显示骨骼结构、肺部病变、体内植入物位置等。成像速度快。但通常不涉及特异性的分子或细胞标记（主要用于结构成像），软组织对比度相对较低（除非使用造影剂），涉及电离辐射。
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特性 |
生物发光（BLI） |
荧光成像（FLI） |
X光成像 |
|---|---|---|---|
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信号源 |
内源性酶促反应 |
外源性探针 + 外部激发 |
外部X射线源 + 组织衰减差异 |
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能量转换 |
化学能→光能 |
光能→光能（斯托克斯位移） |
X射线→电子信号（探测器转换） |
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背景干扰 |
极低（无自体发光） |
中-高（组织自体荧光） |
低（依赖物质密度差异） |
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定量依据 |
光子通量（photons/s/cm²/sr） |
荧光强度（radiance） |
亨氏单位（HU） |
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穿透深度 |
2-3 cm（红光优化） |
1-2 cm（NIR-I区） |
无限制（适用于大动物全身） |
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时空分辨率 |
分钟级（底物扩散限制） |
秒级（快速动态监测） |
微秒级（高速摄影） |
了解了这三种主要成像技术的原理和特点，那么在实际研究中应如何选择呢？
-
什么情况下选择生物发光成像(BLI)?
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什么情况下选择荧光成像(FLI)?
-
什么情况下选择X光成像?
本文将为您详细解答这些关键问题，帮助您根据研究目标选择最合适的成像技术。
| 技术类型 | 实验对象 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 生物发光 | 转基因细胞/动物（表达荧光素酶） | 无背景光干扰、灵敏度高（10⁻15~10⁻17 mol/L） | 需基因改造、信号强度依赖底物代谢 |
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荧光成像 |
细胞/动物（注射荧光探针或标记） | 多色标记、可实时动态监测 | 自体荧光干扰、组织穿透深度有限（<2 cm） |
| X光成像 | 骨骼/植入器械/造影剂标记组织 | 高空间分辨率（μm级）、硬组织成像优势 | 辐射损伤、软组织对比度低 |
实验步骤详解
1. 生物发光成像（BLI）
利用生物发光活体成像技术观察肺癌肿瘤生长情况
模型构建：转染荧光素酶基因（如Luc2）至目标细胞
底物注射：腹腔注射D-荧光素钾盐（150 mg/kg）
信号采集：注射后10-15分钟，暗箱内用高灵敏度CCD相机捕获（曝光60-300 s）
数据分析：通过ROI定量光子通量（photons/s/cm²/sr）
2. 荧光成像（FLI）
利用荧光成像进行细菌研究
探针标记：静脉注射Cy5.5、ICG等近红外探针（发射波长650-900 nm）
滤光系统：设置激发/发射滤光片（如Ex/Em=745/800 nm）
图像获取：麻醉动物后多时点动态扫描（曝光时间≤5 s）
背景扣除：利用光谱分离算法消除自体荧光
活体成像的核心波段：650-850nm
3. X光成像
样本准备：麻醉固定，或注射碘海醇等造影剂
参数设置：电压40-60 kV，电流0.5-1 mA（小动物）
图像采集：曝光时间0.1-5 s，多角度拍摄（可选CT 3D重建）
三维重构：通过Micro-CT获取10-50 μm分辨率体数据
成像效果影响因素及优化建议
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影响因素 |
优化建议 |
|---|---|
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组织穿透深度 |
优先选择近红外荧光探针（650-900 nm） |
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信噪比 |
生物发光：使用冷CCD（-90℃制冷） 荧光：采用时间门控技术 |
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运动伪影 |
麻醉深度控制（异氟烷维持呼吸频率40-60次/分） |
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定量误差 |
校准光源+标准曲线校正，避免饱和曝光 |
常见问题及解决方案
1. 生物发光成像（BLI）
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问题 |
原因分析 |
解决方案 |
|---|---|---|
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信号强度弱 |
- 底物降解 - 基因沉默 |
- 荧光素避光-80℃保存，现配现用 - 改用慢病毒整合载体（如lenti-CMV-Luc2） |
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背景噪声高 |
非特异性底物代谢 |
注射底物后等待10 min再成像（待背景清除） |
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信号分布异常 |
底物扩散不均 |
优先选择尾静脉注射（IV）替代腹腔注射（IP） |
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长期追踪信号衰减 |
免疫清除/细胞丢失 |
使用免疫缺陷鼠（NSG） + 红光优化荧光素酶（Akaluc, λ=670nm） |
2. 荧光成像（FLI）
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问题 |
原因分析 |
解决方案 |
|---|---|---|
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自体荧光干扰 |
血红蛋白/毛发表面反射 |
- 脱毛处理（剃毛+脱毛膏） - 光谱拆分技术（如Bruker多光谱模块） |
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穿透深度不足 |
短波长探针（<600nm） |
换用近红外探针（Cy5.5, ICG, 发射波长>650nm） |
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探针淬灭 |
长时间光照/活性氧损伤 |
- 降低曝光强度（<5 s/帧） - 添加抗淬灭剂（如Trolox） |
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多色串扰 |
激发/发射光谱重叠 |
优化滤光片组合（带宽±10nm） + 顺序扫描模式 |
3. X光成像（含Micro-CT）
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问题 |
原因分析 |
解决方案 |
|---|---|---|
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软组织对比度差 |
低X光吸收差异 |
- 荧光素避光-80℃保存，现配现用 - 改用慢病毒整合载体（如lenti-CMV-Luc2） |
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金属植入物伪影 |
射线硬化效应 |
- 提高kVp（60-90 kV） - 加装0.5mm铜滤片 |
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辐射损伤影响生理 |
累积辐射剂量过高 |
限制单次扫描<50 mGy + 多模态交替（如关键时点CT+日常BLI监测） |
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三维重建失真 |
运动伪影/采样不足 |
- 呼吸门控技术 - 增加投影角度（>360步） |
4. 多模态融合
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问题 |
解决方案 |
|---|---|
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BLI/FLI与X光配准误差 |
使用仿射变换算法 + 内置定位光源（如PerkinElmer IVIS Spectrum CT） |
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造影剂干扰光学信号 |
错时成像：先X光（造影剂代谢快）→ 后BLI/FLI |
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多探针交叉反应 |
设计正交探针系统： - BLI底物：D-荧光素 - FLI探针：Alexa Fluor 750 - X光造影剂：碘化油 |
小动物活体成像技术未来将向多模态实时融合（如荧光/PET/超声联动）、超高分辨率（亚细胞级活体成像）、无标记检测（人工智能辅助光谱解析）三大方向突破。面对技术复杂化与资源集约化的双重挑战，代轩生物集成生物发光、荧光成像、X光成像三模技术，提供从探针优化到多维度数据分析的闭环平台，助力研究者抢占精准医学创新先机。
代轩生物丨活体成像服务优势——生物发光 · 荧光成像 · X光成像
1. 多模态无缝整合
技术联动：支持生物发光/荧光/X光同步扫描，一次实验同步获取功能代谢信号（如肿瘤细胞活性）与高精度解剖结构（如微CT 50μm分辨率）
数据互证：AI驱动多模态图像自动配准（误差<0.1mm），消除体位差异，确保药物分布与病灶定位精准对应
特色案例：在CAR-T细胞治疗研究中，生物发光动态示踪免疫细胞浸润路径 + X光定位骨转移灶，双系统验证靶向效率
2. 超灵敏度检测能力
深度穿透：
近红外二区（NIR-II）荧光成像穿透深度达2.5cm（超越传统NIR-I的1cm极限）
生物发光检出限低至500个细胞（IVIS Spectrum CT系统优化光子采集）
抗干扰技术：
多光谱分离算法有效剥离肝脏/肠道自发荧光，信噪比提升8倍
定制化底物给药方案（如静脉注射D-荧光素）提升信号动力学准确性
3. 工业级标准化体系
GLP合规：符合新药申报要求的药代动力学研究规范
时效保障：
标准项目7日内交付
加急服务48小时提供原始数据
成本优化：共享平台机时费比自建实验室低30%
4. 临床前研究深度赋能
转化医学支持：
术中荧光导航技术转化（已应用于乳腺癌前哨淋巴结定位）
纳米探针靶向效率验证（抗体/多肽偶联NIR染料）
多组学关联：整合转录组测序与成像数据，解析信号通路机制
