流式细胞术精准捕捉“胞内钙离子动态”
细胞内钙离子（Ca²⁺）作为进化保守的第二信使，通过浓度瞬变（钙瞬变）精密调控免疫激活、神经兴奋、基因转录及细胞凋亡等核心生命过程。实时捕捉钙信号动态，对揭示疾病机制（如神经退行、心血管病变）和药物作用通路（如GPCR靶点）具有不可替代的价值。
流式细胞术凭借其单细胞分辨率、毫秒级实时监测能力及高通量分析优势，结合特异性钙荧光探针技术，成为解析复杂细胞群体中钙信号异质性的金标准。
常见的钙离子荧光探针及其原理
1、Fluo 系列（如 Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8）
激发/发射波长：~490 nm / ~520 nm（绿色荧光）
特点：单波长探针，结合钙离子后荧光强度显著增强（最高可达100倍），适合流式检测。
原理：通过乙酰甲酯（AM酯）修饰穿透细胞膜，胞内酯酶水解后释放活性探针，与Ca²⁺结合后荧光增强。
2、Indo-1
激发/发射波长：~350 nm / 405 nm（结合态）或 485 nm（游离态）
特点：比率型探针，通过405 nm/485 nm荧光比值计算钙浓度，不受细胞大小或染料负载量影响。
原理：结合Ca²⁺后发射峰蓝移（485 nm → 405 nm）。
3、Fura 系列（如 Fura-2）
激发波长：340 nm（结合态）和 380 nm（游离态），发射~510 nm
特点：双激发比率探针，适合显微镜，流式应用较少（需紫外激光）。
通用工作原理：
细胞负载：探针以AM酯化形式（疏水性）穿透细胞膜 → 胞内酯酶水解为羧酸形式（亲水性，滞留胞内）。
钙结合响应：游离探针荧光弱，结合Ca²⁺后构象改变，荧光增强（Fluo系列）或发射峰位移（Indo-1）。
检测信号：流式细胞仪检测荧光强度变化，反映胞内Ca²⁺动态。
探针选择丨实验设计建议
钙离子荧光探针实验步骤
01、细胞准备
收集细胞（如淋巴细胞、培养细胞系），调整密度至 1×10⁶ cells/mL，用无血清/PBS缓冲液洗涤。
02、探针负载
将荧光探针（如 Fluo-4 AM）用DMSO配制成1-5 mM储存液，避光保存。
工作液制备：用含0.02% Pluronic F-127的缓冲液稀释至1-5 μM（终浓度）。
37℃避光孵育 30-60分钟（促进AM酯进入和转化）。
03、洗涤与平衡
用预温的缓冲液洗涤2次，去除胞外探针。
重悬细胞，37℃避光静置15分钟（稳定信号）。
04、流式检测
设置流式细胞仪：
激发光源：488 nm激光（Fluo-4）或 355 nm紫外激光（Indo-1）。
检测通道：FITC（Fluo-4）或 双通道（Indo-1：405/30 nm 和 485/20 nm）。
建立基线：采集未刺激细胞荧光信号30秒。
动态检测：加入刺激剂（如离子霉素、抗原、药物），连续监测荧光变化1-10分钟。
检测原理：
单探针（如 Fluo-4）：Ca²⁺浓度升高 → 探针结合Ca²⁺ → 荧光强度↑ → 直接反映钙瞬变。
比率探针（如 Indo-1）：计算 R = F405/F485，R值与Ca²⁺浓度正相关，可定量校准。
注意事项：
✔ 探针负载优化：
避免浓度过高（毒性）或过低（信号弱）。
使用Pluronic F-127增加疏水性探针溶解度。
✔ 严格避光：探针见光易淬灭，全程避光操作。
✔ 温度控制：维持37℃（钙信号受温度影响）。
✔ 刺激剂添加方式：使用流式细胞仪"快速混样"功能，避免中断采集。
✔ 对照设置：
阴性对照：未刺激细胞。
阳性对照：离子霉素（最大钙响应）→ EGTA（最小荧光）。
代轩生物——流式钙离子浓度检测服务
全流程检测：从细胞处理、探针负载、刺激到流式动态监测。
探针可选：Fluo-4（常用）、Indo-1（比率法）、Rhod-2（线粒体钙）等。
定制化方案：针对不同细胞类型（免疫细胞、神经元、肿瘤细胞）优化实验条件。
代轩生物丨流式钙离子浓度检测示例数据
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★ 核心优势 ★ |
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高灵敏度流式平台 |
配备紫外-可见多激光系统，支持Fluo-4（488 nm）和Indo-1（355 nm）双模式检测。 |
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动态监测能力 |
实时采集每秒数千细胞数据，捕捉钙震荡（calcium oscillations）等快速信号。 |
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专业数据分析 |
- 荧光强度随时间变化曲线 - 钙响应峰值/面积统计 - Indo-1比率法定量 |
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严格质量控制 |
每批次实验包含阳/阴性对照，确保数据可靠性。 |
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样本量要求低 |
最低需1×10⁵细胞（适合珍贵样本）。 |
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