流式细胞术凋亡检测指南 | 实验原理、步骤与结果分析详解
细胞凋亡，或称程序性细胞死亡，是维持机体稳态、清除异常或多余细胞的关键生理过程。在生物医学研究中，准确检测和定量凋亡细胞至关重要。流式细胞术凭借其高通量、多参数、定量的优势，成为检测细胞凋亡的金标准方法。其中最常用、最经典的技术就是 Annexin V 结合 / 碘化丙啶（PI）双染法。
01、核心原理
Annexin V：识别早期凋亡细胞。在凋亡早期，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞膜内侧翻转到外侧（这是重要的“吃我”信号）。Annexin V 是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对 PS 具有高亲和力。它能特异性结合暴露在细胞膜外侧的 PS，标记早期凋亡细胞。
碘化丙啶（PI）：识别晚期凋亡和坏死细胞。PI 是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜。只有当细胞膜完整性丧失（晚期凋亡或坏死）时，PI 才能进入细胞，与 DNA/RNA 结合发出荧光。活细胞和早期凋亡细胞（膜完整）拒染 PI。
通过同时检测 Annexin V 和 PI 的信号，我们可以将细胞群体精确地区分为四类：
Annexin V⁻ / PI⁺：坏死细胞（膜完整性丧失，但PS未外翻或已降解）
Annexin V⁺ / PI⁺：晚期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整性丧失）
Annexin V⁻ / PI⁻：活细胞（正常/未凋亡）
Annexin V⁺ / PI⁻：早期凋亡细胞（膜PS外翻，膜完整）
02、实验步骤——Annexin V/PI 双染法（ 以贴壁细胞为例）
试剂与耗材
- 细胞样本（处理组和对照组）
- 1x Annexin V 结合缓冲液（通常由试剂盒提供或自配：10mM HEPES, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl₂, pH 7.4）
- FITC（或其他荧光素）标记的 Annexin V
- 碘化丙啶（PI）溶液（工作浓度通常为 1-5 μg/mL）
- PBS（无钙镁）
- 胰酶（不含EDTA或含低浓度EDTA）或温和细胞刮刀
- 流式管
- 离心机
- 冰
- 移液器及枪头
操作流程
细胞准备与处理：
将细胞接种于培养板/皿中，生长至合适密度。
施加凋亡诱导因素（如药物、射线、饥饿等）或对照处理。注意：根据实验目的优化处理时间（通常几小时到几十小时），以获得合适的凋亡比例。
关键点：处理时间结束时，确保收集足够数量的细胞（通常 ≥ 106 个/样本）。
细胞收集
贴壁细胞：
- 轻柔吸弃培养液。避免直接冲击细胞！
- 用预冷的 PBS 轻轻洗涤细胞 1-2 次。
- 方法一（推荐）：加入适量不含EDTA或含低浓度EDTA的胰酶（如Accutase）消化，时间尽量短（通常30秒-1分钟），待细胞刚刚开始变圆松动时，立即加入含血清的培养基终止消化。轻柔吹打收集细胞。（避免过度消化损伤细胞膜）
- 方法二：用预冷的 PBS 洗涤后，直接用预冷的细胞刮刀轻柔刮下细胞，收集到离心管中。（物理方法可能增加机械损伤）
悬浮细胞：直接离心收集细胞（通常 300g, 5分钟），弃上清。
洗涤：
用预冷的 PBS 轻柔重悬细胞。
离心（300g, 5分钟），弃上清。重复洗涤一次。（去除残留培养基和血清）
重悬于结合缓冲液：
用适量的 1x Annexin V 结合缓冲液（通常100-500μL）轻柔重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液。避免剧烈吹打产生气泡！
将细胞悬液转移到流式管中。
Annexin V 染色：
根据试剂说明书推荐量（通常每 10⁵-10⁶ 个细胞加 1-5μL），加入 FITC-Annexin V（或其他荧光素标记的 Annexin V）。注意避光操作。
轻柔混匀。
冰上避光孵育 10-15分钟。（低温减少细胞状态变化，避光防止荧光淬灭）
PI 染色（可选，但强烈推荐双染）：
孵育结束前 5 分钟或孵育结束时，加入 PI 溶液（终浓度通常 1-5 μg/mL）。注意避光操作。
轻柔混匀。
如果只加PI，则立即上机检测；如果同时加了Annexin V和PI，可继续冰上避光放置≤5分钟（或按说明书要求）。
上机检测：
在染色完成后 1 小时内完成流式检测！（时间过长会影响结果准确性）
无需洗涤（避免损失结合的Annexin V或细胞）。
立即将样品置于流式细胞仪上机检测。注意避光。
关键点：设置合适的电压和补偿。通常需要：
- FSC/SSC 散点图：圈门排除碎片和粘连细胞（选择目标细胞群）。
- FITC-Annexin V 通道（如 FL1） vs PI 通道（如 FL2 或 FL3）的散点图或密度图。
- 未染色细胞：设置电压和调节荧光背景。
- 单染 FITC-Annexin V 细胞（不加PI）：用于调节 FL1 对 FL2/FL3 的补偿（补偿掉 FITC 荧光在 PI 通道的渗漏）。
- 单染 PI 细胞（不加 Annexin V）：用于调节 FL2/FL3 对 FL1 的补偿（补偿掉 PI 荧光在 FITC 通道的渗漏）。
03、结果解读——四象限图里的奥秘
流式细胞仪分析软件（如 FlowJo, FCS Express, BD FACSDiva 等）会生成关键的双参数散点图或密度图：X轴通常是 Annexin V 荧光强度（如 FITC），Y轴是 PI 荧光强度。
象限划分
左下象限 (Q4: Annexin V⁻ / PI⁻)：活细胞。细胞未被染色或仅有很低的自发荧光。
右下象限 (Q3: Annexin V⁺ / PI⁻)：早期凋亡细胞。Annexin V 阳性（结合了暴露的PS），PI 阴性（膜完整）。
右上象限 (Q2: Annexin V⁺ / PI⁺)：晚期凋亡细胞或坏死细胞。Annexin V 阳性，PI 阳性（膜完整性丧失）。在标准的凋亡进程中，这些细胞通常由早期凋亡发展而来（继发性坏死）。
左上象限 (Q1: Annexin V⁻ / PI⁺)：坏死细胞或机械损伤细胞。Annexin V 阴性（PS未暴露或已降解），PI 阳性（膜完整性严重破坏）。如果实验操作非常小心，这个象限的细胞比例应该很低；高比例可能提示样本处理不当（如过度消化或吹打）或样本本身包含大量原发坏死细胞。
关键参数与报告：
总凋亡率：Q3%（早期凋亡）+ Q2%（晚期凋亡）
早期凋亡率：Q3%（早期凋亡）
晚期凋亡/坏死率：Q2%（晚期凋亡）
坏死/损伤率：Q1%（坏死）
存活率：Q4%（活细胞）
解读示例：
对照组：Q4（活细胞）占绝大多数，Q3（早期凋亡）和Q2（晚期凋亡）比例很低（通常<5-10%），Q1（坏死）非常低。
凋亡诱导组：
- 如果药物/处理主要诱导早期凋亡：Q3（早期凋亡）比例显著升高，Q2（晚期凋亡）可能略有升高，Q4（活细胞）降低。
- 如果处理时间较长或作用较强：Q2（晚期凋亡）比例显著升高，Q3（早期凋亡）可能仍然较高或开始下降（细胞进入晚期），Q4（活细胞）显著降低。
- 如果处理导致大量快速坏死：Q1（坏死）和Q2（晚期凋亡/坏死）比例显著升高，Q3（早期凋亡）可能不高。
比较不同处理组：计算并比较各组的总凋亡率（Q3+Q2）或早期/晚期凋亡率，结合统计学分析（如t检验、ANOVA），判断不同处理对细胞凋亡的影响是否具有显著性差异。
04、注意事项与优化技巧
样本新鲜度
处理后的细胞尽快检测（<1小时），避免放置过久导致自发凋亡增加或状态变化。
轻柔操作
所有步骤（收集、洗涤、重悬）务必轻柔，避免强力吹打或离心速度过高导致机械损伤（假阳性PI染色，误判为坏死）。
胰酶选择
贴壁细胞消化首选不含EDTA或含低浓度EDTA的温和消化酶（如Accutase），并严格控制消化时间。EDTA会螯合钙离子，而Annexin V结合PS需要钙离子！如果用含EDTA胰酶，必须彻底洗净EDTA（多洗几次）才能进行Annexin V染色。
钙离子依赖
Annexin V结合缓冲液必须含有足够浓度的Ca²⁺（通常2.5mM）。确保缓冲液新鲜配制或保存得当。
避光与低温
Annexin V 和 PI 染色及后续操作需在冰上避光进行，防止荧光淬灭和细胞状态变化。
浓度优化
不同细胞类型或不同批次的试剂，Annexin V 和 PI 的最佳工作浓度可能略有差异，建议预实验确定。
补偿调节
必须做！FITC和PI的荧光光谱有重叠，不做补偿或补偿不当会导致结果严重偏差（如早期凋亡细胞被误分到晚期凋亡象限）。
设置对照
必不可少！
未染色对照：设置细胞电压。
单染对照 (FITC-Annexin V only)：调节补偿（FITC → PI通道）。
单染对照 (PI only)：调节补偿（PI → FITC通道）。
生物学对照：未处理细胞（阴性对照），强凋亡诱导剂处理的细胞（阳性对照，如星形孢菌素STS）。
细胞浓度
上机时细胞浓度不宜过高或过低，避免堵塞管路或信号太弱。通常调整到事件率在1000-3000个细胞/秒左右。
数据分析
圈门策略要合理（先FSC/SSC排除碎片和粘连体），正确识别目标细胞群后再分析Annexin V/PI信号。注意区分真正的凋亡信号和背景噪音。
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- 活细胞 (Annexin V⁻/PI⁻)：左下象限，活力基线；
- 早期凋亡细胞 (Annexin V⁺/PI⁻)：右下象限，捕获PS外翻关键瞬间；
- 晚期凋亡/坏死细胞 (Annexin V⁺/PI⁺)：右上象限，膜完整性丧失标志；
- 原发坏死/损伤细胞 (Annexin V⁻/PI⁺)：左上象限，提示操作或样本问题。
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关键定量分析：
- 活细胞率 (%，Q4 - Annexin V⁻/PI⁻)
- 早期凋亡率 (%，Q3 - Annexin V⁺/PI⁻)
- 晚期凋亡/坏死率 (%，Q2 - Annexin V⁺/PI⁺)
- 总凋亡率 (%，Q3+Q2，核心指标！)
- 坏死/损伤率 (%，Q1 - Annexin V⁻/PI⁺)
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