流式细胞周期分析操作指南

原因：洗涤步骤离心损失；重悬过于剧烈损伤细胞；起始细胞数不足。

解决方案：

起始细胞数：进行细胞计数，确保最终染色后每管有至少 2 x 10⁶ 个细胞。

洗涤技巧：

• 离心后，用 200 μL 精细吸头 (黄色枪头) 小心吸弃上清。

• 不要吸得太干净！保留约 10-20 μL 液体在管底，避免吸走细胞团块。

• 轻柔重悬细胞沉淀，避免剧烈吹打产生气泡和碎片。

离心参数：使用合适的离心力（通常 300-400g）和时间（5-10分钟），避免过度离心导致细胞压紧难以重悬或损伤。

原因：PI 粘附性强；固定时乙醇加入过快导致蛋白变性聚集；样品本身有聚集。

解决方案：

固定关键：将预冷乙醇逐滴加入持续涡旋的细胞悬液中（或反过来将细胞悬液逐滴加入乙醇中）。

过滤：上机前必须过滤！

数据分析：必须去除粘连体！使用 FSC-A/FSC-H 或 PI 的 FL2-A/FL2-W (或对应染料的 Area/Width) 参数设门排除粘连体。粘连体会被误认为是 G2/M 期甚至多倍体细胞，导致结果严重偏差。

缓冲液：染色和上样缓冲液中可加入少量 BSA (0.1-1%) 或 EDTA (0.5-1 mM) 有助于减少非特异性聚集。

上样速度：使用较低的样品上样流速，减少流体压力导致的聚集。

原因：染色不均；仪器状态不佳；细胞碎片多；上样速度过快。

解决方案：

染色优化：确保 RNase 充分消化 (PI/DAPI)；保证染料浓度和孵育时间合适且一致；避光。

样品质量：减少细胞碎片（轻柔操作，必要时用 PBS 洗涤去除死细胞/碎片）。

仪器校准：定期用标准微球校准仪器，确保光路和液流稳定，CV 值符合要求。

上样速度：采用低速上样，使细胞逐个稳定通过检测点。

数据分析：确保在分析 DNA 含量直方图时，排除碎片和粘连体后，G0/G1 主峰尖锐（CV 值通常应 <8% 为佳，<10% 可接受）。

PI/DAPI + RNAse：绝对必须！忘记 RNase 会导致荧光信号异常增高（RNA+DNA），无法得到正确周期分布。

活细胞染料(Hoechst, Vybrant)：注意细胞毒性，浓度过高或孵育时间过长会影响细胞活力和周期进程。需严格优化条件。活细胞分析避免了固定可能带来的影响。

双标法：结合使用 BrdU/EdU（标记新合成 DNA）和 DNA 染料（如 PI 或 Vybrant）。

BrdU/EdU 阳性细胞即为 S 期细胞，结合 DNA 含量分析可以更精确地区分早期 S、中期 S、晚期 S 期细胞。

线性 vs 对数坐标：DNA 含量直方图必须使用线性坐标轴 (LIN) 显示荧光强度。

脉冲信号：采集数据时，必须勾选并记录荧光信号的面积 (A) 和宽度 (W)（以及高度 H），这是进行粘连体去除 (Doublet Discrimination) 的基础。

设门策略：

• FSC/SSC 或活染料 (如 DAPI 通道的活/死区分) 去除碎片和死细胞。

• FSC-A/FSC-H 或 FL2-A/FL2-W (或对应染料 A/W) 去除粘连体。

• 在剩下的单细胞群体上分析 DNA 含量直方图。

拟合模型：使用专业软件（如 FlowJo, ModFit LT, FCS Express 等）的细胞周期拟合模块进行定量分析。不同模型（如 Dean-Jett-Fox, Watson Pragmatic）适用于不同情况，需根据峰形和数据质量选择。

对照：设置未处理或正常生长的细胞作为对照，用于设定门和分析参数。

重复：生物学重复和技术重复对于结果的可靠性至关重要。

安全：PI 是诱变剂，DAPI/Hoechst 也是核酸染料，操作时需戴手套，在指定区域操作，废液按有害化学废液处理。乙醇易燃，注意防火。

仪器配置：确保流式细胞仪的激光器和滤光片配置能激发和检测所选染料（如 PI 常用 488nm 激发，用 610/20nm 或 575/26nm 滤片收集；DAPI/Hoechst 需要紫外或近紫外激光激发）。