复旦团队发现：Foxp3经线粒体重编程CAR-T代谢，提升实体瘤治疗持久性

CAR-T疗法在血液瘤中效果显著，但受限于实体瘤的低糖、缺氧、高乳酸微环境，易致细胞能量枯竭与功能耗竭。调节性T细胞（Treg）因其脂代谢优势能在该环境中存活，提供了重要启示。

Foxp3是Treg的关键转录因子。复旦大学储以微、骆菲菲团队最新研究发现，Foxp3可通过非转录依赖的方式调控CAR-T细胞的线粒体动态，重塑其代谢表型（如增强脂代谢适应性），使其获得在实体瘤严苛微环境中的生存优势，从而显著提升治疗的持久性与有效性。该研究为突破实体瘤CAR-T治疗瓶颈提供了“增效减毒”的创新策略，成果发表在期刊《Cell Metabolism》上（IF=27.7）。

图片来源：www.cell.com

一、CAR-T_Foxp3细胞获得了与CAR-T_Conv细胞不同的代谢特性

研究构建了共表达Foxp3和第三代CAR结构的CAR-T_Foxp3细胞。抗原刺激下，CAR-T_Foxp3细胞整体代谢活性降低，表现为糖酵解（ECAR）和氧化磷酸化（OCR）水平下降。代谢流分析显示其葡萄糖和谷氨酰胺利用减少，ATP水平降低，但NAD/NADH比值升高。

代谢组学揭示CAR-T_Foxp3细胞脂质（甘油三酯、脂滴）和氨基酸代谢通路显著改变，呈现类似Treg的代谢特征。同时，其线粒体膜电位和质量下降。抑制OXPHOS的药物可逆转脂滴积聚，表明Foxp3通过抑制OXPHOS促进了脂质代谢活化。

图1. CAR-T_Foxp3细胞获得了与 CAR-T_Conv细胞不同的代谢特性

二、Foxp3与Drp1结合决定CAR-T细胞的代谢特性

研究发现Foxp3特异性结合线粒体裂变关键蛋白Drp1（而非融合蛋白），并抑制Drp1第616位丝氨酸（Ser616）的磷酸化，导致CAR-T_Foxp3细胞线粒体更融合、聚集且数量减少。

通过缺失突变体定位，确定Foxp3的第340-390氨基酸片段是结合Drp1（推测结合Drp1第600-620位）并抑制其Ser616磷酸化的关键区域。缺失此片段（CAR-T_{Foxp3 (340-390)}）的细胞恢复了线粒体数量、膜电位、糖酵解与OXPHOS能力以及正常脂滴水平，证明Foxp3通过结合并抑制Drp1活性来重塑线粒体动态和细胞代谢。

图2. CAR-T_Foxp3细胞的代谢特征由Foxp3与Drp1结合决定

三、CAR-T_Foxp3细胞无法获得Treg的染色质可及性和抑制功能

ATAC-seq分析显示CAR-T_Foxp3细胞的染色质开放区域分布与CAR-T_Conv相似，与Treg显著不同。Treg特有的开放区域富集免疫抑制相关转录因子结合位点，而CAR-T_Foxp3缺乏此特征。

功能上，CAR-T_Foxp3细胞分泌IL-10、TGF-β和表达CTLA-4水平极低，且不能抑制T细胞增殖，证明其不具备Treg的抑制功能。少数CAR-T_Foxp3与Treg共享的开放区域主要富集于代谢相关通路，其代谢状态改变（如乳酸、NADH下降）可能影响染色质可及性，但核心表观遗传程序和免疫抑制功能未被诱导。

图3. CAR-T_Foxp3细胞无法获得 Treg 的染色质可及性和抑制功能

四、Foxp3介导的代谢下调CAR-T_Foxp3细胞中衰竭相关抑制分子的表达

与肿瘤细胞共培养时，CAR-T_Foxp3细胞高表达CD27、CD28、CD62L、BCL-6等记忆/活化分子，而关键耗竭标志物PD-1、LAG-3、TIM-3的表达显著低于CAR-T_Conv细胞，且三重/双重阳性细胞比例更低。其细胞毒性与CAR-T_Conv相当，但效应因子（GZMB, IFN-γ, TNF-α）分泌略低。

经多轮抗原刺激，CAR-T_Foxp3细胞增殖更持久且耗竭更轻。若缺失Foxp3的Drp1结合域（340-390）或使用Drp1抑制剂（P110）或抑制脂代谢（DCA），均会逆转其低耗竭表型，证明Foxp3-Drp1互作介导的代谢重编程是其抵抗耗竭的关键。

图4. Foxp3介导的代谢下调CAR-T_Foxp3细胞中衰竭相关抑制分子的表达

五、CAR-T_Foxp3细胞表现出强大的抗肿瘤活性，并降低了体内耗竭标志物

在荷瘤小鼠模型中，CAR-T_Foxp3细胞展现出最强的抗肿瘤效果（肿瘤生长最慢、瘤重最低）。瘤内浸润的CAR-T_Foxp3细胞持续高表达Foxp3，同时PD-1、LAG-3、TIM-3表达显著下调。

RNA测序显示CAR-T_Foxp3细胞耗竭相关基因（TIM-3, LAG-3, EOMES, CXCL13）表达下调，整体处于更低耗竭状态。其转录谱虽与Treg有部分代谢相关基因重叠，但整体差异显著，且富集于线粒体通路，表明其独特表型是Foxp3介导的代谢重编程结果，而非向Treg转化。

图5. CAR-T_Foxp3细胞表现出强大的抗肿瘤活性，并降低了体内耗竭标志物

六、Foxp3在CAR-T_Foxp3细胞体内维持持久的抗肿瘤作用和低水平的衰竭标志物

在肿瘤清除后“再挑战”模型中，CAR-T_Foxp3组治愈小鼠对二次肿瘤攻击的抵抗力更强（复发更慢）。其外周血中初始/干细胞样记忆T细胞（T_N/T_SCM）比例更高，终末效应细胞（T_EMRA）比例更低。

缺失Foxp3关键结合域（340-390）的CAR-T_Foxp3细胞（CAR-T_{Foxp3(340-390)}）在再挑战模型中失去了增强的抗肿瘤持久性和低耗竭优势（肿瘤生长速度与CAR-T_Conv相当，耗竭标志物升高），证实该片段对维持Foxp3赋予的持久抗瘤能力和低耗竭表型至关重要。

图6. Foxp3在CAR-T_Foxp3细胞体内维持持久的抗肿瘤作用和低水平的衰竭标志物

七、CAR-T_Foxp3细胞在人源化NSG模型中获得强效抗肿瘤活性，但没有获得免疫抑制

在人源化免疫系统（hu-NSG）荷瘤模型中，CAR-T_Foxp3细胞展现出显著抗肿瘤活性（部分完全缓解），其瘤内PD-1、LAG-3表达低于CAR-T_Conv，CD4⁺ T细胞浸润增加。

血清细胞因子分析显示CAR-T_Foxp3组TNF-α与IL-10水平显著低于对照组，细胞因子释放更平稳，提示细胞因子风暴风险降低。脾脏及主要器官未见毒性，且免疫细胞组成未显示免疫抑制迹象，证实其在人源背景下兼具强效、安全且无免疫抑制特性。

图7. CAR-T_Foxp3细胞在人源化 NSG 模型中获得强效抗肿瘤活性，但没有获得免疫抑制

总 结

该研究发现Foxp3通过其第340-390片段直接结合并抑制线粒体裂变蛋白Drp1（降低Ser616磷酸化），重塑CAR-T细胞代谢：抑制糖酵解与OXPHOS，增强脂代谢。这赋予CAR-T_Foxp3细胞在严苛实体瘤微环境中的生存优势和功能持久性。在多种模型（小鼠、人源化）中，CAR-T_Foxp3细胞展现出显著增强的抗肿瘤活性、更低的耗竭标志物表达、更高的记忆潜能，且不具备Treg的免疫抑制功能及显著毒性。

总的来说，该研究强调了Foxp3代谢重编程提升CAR-T细胞抗实体瘤治疗疗效，为开发高持久性-低毒性的新型CAR-T疗法提供了理论基础。

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