解码生命调控密码｜EMSA & ChIP 蛋白-核酸互作检测黄金方案

问题

可能原因

解决方案

探针标记效率低或无标记

标记酶活性降低：T4 多聚核苷酸激酶等酶保存不当（如反复冻融）。

ATP / 标记物失效：放射性 α-32P-ATP 或荧光标记 dNTP 超过保质期。

反应体系错误：缓冲液成分遗漏（如 Mg²⁺）或探针浓度过高 / 过低。

酶活性验证：使用新鲜分装的酶，避免反复冻融，实验前用已知探针做阳性对照。

试剂更换：检查 ATP / 标记物的有效期，重新配制或购买新试剂。

优化体系：严格按照试剂盒说明书调整探针浓度（通常 10-50 ng），确保缓冲液成分完整。

延长反应时间：标记反应可在 37℃延长至 60 分钟，或增加酶的用量。

电泳后无条带或条带模糊

蛋白质与探针结合效率低：蛋白质浓度不足或变性失活（如未使用蛋白酶抑制剂）；探针未纯化，含杂质抑制结合。

电泳条件不当：凝胶浓度不合适（如 DNA 探针常用 4%-6% 聚丙烯酰胺凝胶，RNA 需更高浓度）；电泳缓冲液失效（TBE 或 TAE 缓冲液重复使用次数过多）。

非特异性结合干扰：未添加足够的非特异性竞争 DNA（如 Poly (dI・dC)）。

优化蛋白质制备：使用新鲜提取的蛋白质，添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF）防止降解；通过预实验确定最佳蛋白浓度（建议梯度测试 50-500 ng）。

探针纯化：标记后通过乙醇沉淀或柱纯化去除未结合的标记物和杂质。

调整电泳参数：根据探针长度选择凝胶浓度（短探针用高浓度，长探针用低浓度）；更换新鲜配制的 1× TBE 缓冲液，电泳温度控制在 4℃（避免核酸变性）。

增加竞争剂：非特异性竞争 DNA 的用量通常为探针的 50-100 倍，特异性竞争 DNA 为 10-100 倍。

非特异性条带过多

竞争剂不足：未添加或用量不够，导致蛋白质与探针非特异性结合。

探针浓度过高：过量探针与蛋白质非特异性结合。

反应缓冲液成分问题：缺乏 Mg²⁺、Zn²⁺等辅助因子，或盐浓度过高抑制结合。

优化竞争条件：增加非特异性竞争 DNA（如 Poly (dI・dC)）的用量，或加入载体蛋白（如 BSA）减少非特异性吸附。

降低探针浓度：将探针浓度降至 1-5 nM，避免过量结合。

调整缓冲液：补充 MgCl₂（1-5 mM）或 ZnCl₂（0.1-1 mM）促进蛋白质 - DNA 结合；降低 NaCl 浓度（通常 10-100 mM），过高盐浓度会破坏结合力。

特异性验证：加入抗体进行超迁移实验（Super Shift），确认特异性条带（抗体 - 蛋白 - DNA 复合物迁移率更低）。

条带迁移率异常

蛋白质聚合或降解：蛋白质形成多聚体导致迁移率降低，或降解为小片段导致迁移率升高。

探针二级结构影响：探针自身形成发夹结构，影响与蛋白质的结合及迁移率。

凝胶交联度异常：丙烯酰胺与 bis 丙烯酰胺比例错误（通常 29:1），导致凝胶孔径不均。

蛋白质状态优化：用 Native-PAGE 检测蛋白质纯度，避免聚合或降解（可添加 10% 甘油稳定蛋白质）；若蛋白质易聚合，可在反应体系中加入 0.1% NP-40 等去垢剂破坏聚合体。

探针预处理：标记前对探针进行变性 - 复性处理（95℃加热 5 分钟，冰浴退火），消除二级结构。

重新配制凝胶：严格按照丙烯酰胺与 bis 丙烯酰胺比例（29:1）配制，确保凝胶均匀凝固。

曝光/成像信号弱或背景高

探针标记效率低：同 “探针标记效率低” 问题。

洗膜 / 洗涤不充分：未结合的探针残留导致背景高（尤其荧光检测时）。

检测条件不当：放射性曝光时间过短，或荧光成像仪参数设置错误（如曝光时间、增益过高）。

提高标记效率：参考 “探针标记效率低” 的解决方案，确保标记后探针比活性足够。

优化洗涤步骤：

放射性实验：电泳后用 0.5× TBE 缓冲液洗胶 10-15 分钟，去除游离探针。

荧光实验：用含 0.1% Tween-20 的 PBST 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。

调整检测参数：

放射性曝光：延长曝光时间（如从 12 小时增至 24 小时），或使用增感屏增强信号。

荧光检测：降低激发光强度或曝光时间，避免背景过曝。

重复实验结果不一致

试剂批次差异：蛋白质提取物、探针或缓冲液批次不同，导致结合效率不稳定。

操作误差：反应体系配制时体积误差、凝胶厚度不均一或电泳温度波动。

蛋白质活性变化：冻融次数过多导致蛋白质活性下降。

标准化试剂：使用同一批次的蛋白质提取物，分装保存避免反复冻融（-80℃保存，每次用新鲜分装）；探针标记后定量浓度，确保每次实验用量一致。

规范操作：使用微量移液器精确配制反应体系，避免气泡；制胶时确保玻璃板水平，凝固时间一致（通常 30-60 分钟）；电泳过程中保持温度稳定（可在冷室中进行）。

设置内对照：每次实验加入已知结合的阳性对照（如 SP1 与 DNA 探针），验证体系稳定性。

问题

可能原因

解决方案

背景高 / 非特异性结合严重

抗体特异性不足：抗体识别非目标蛋白，或与 DNA 非特异性结合。

超声破碎不充分：染色质片段过大（>1000 bp），导致非特异性沉淀。

封闭不彻底：磁珠 / 琼脂糖珠未用 BSA 或鲑鱼精 DNA 充分封闭。

洗涤不充分：未有效去除非特异性结合的染色质片段。

验证抗体特异性：使用 Western blot 预验证抗体对目标蛋白的识别能力；选择 ChIP 级抗体（注明适用于 ChIP 实验），避免使用 IHC 或 WB 专用抗体。

优化超声条件：调整超声功率和时间（如 200 W，每次 30 秒，共 10 次），目标片段长度控制在 200-500 bp；超声时保持样本在冰浴中，防止蛋白质变性。

增强封闭效果：磁珠封闭液中添加 5% BSA 和 100 μg/mL 鲑鱼精 DNA，室温孵育 30 分钟；避免使用脱脂奶粉（含 DNA 酶），改用 BSA 作为封闭剂。

严格洗涤步骤：增加洗涤次数（如 5 次），使用含高盐（150-500 mM NaCl）和 Triton X-100 的洗涤缓冲液；最后一次洗涤用低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）去除残留盐离子。

目的基因富集效率低

交联不充分：甲醛浓度不足或交联时间过短，蛋白质 - DNA 复合物解离。

抗体量不足：抗体浓度过低，无法有效捕获目标蛋白。

染色质片段丢失：超声后碎片沉淀或操作中损失。

PCR 效率问题：引物设计不合理或 qPCR 体系污染。

优化交联条件：常用 1% 甲醛室温交联 10-15 分钟，加甘氨酸（终浓度 125 mM）终止反应；贴壁细胞交联时需确保甲醛均匀接触，悬浮细胞需充分重悬。

调整抗体用量：预实验测试抗体浓度（如 5-10 μg/10⁷ cells），避免过量（可能导致非特异性结合）；加入抗体后 4℃旋转孵育过夜，增强结合效率。

减少样本损失：超声后离心（12000 g, 10 分钟）取上清，避免吸入沉淀的细胞碎片；磁珠结合时轻柔颠倒混合，避免剧烈涡旋导致磁珠破碎。

优化 PCR 体系：设计跨核小体的引物（扩增片段 80-150 bp），用 Input DNA 验证引物效率；使用 ChIP 级 qPCR 试剂盒，避免外源 DNA 污染（实验器材高压灭菌，戴手套操作）。

DNA 片段降解严重

超声过度：功率过高或时间过长，导致 DNA 碎片化。

核酸酶污染：实验器材或试剂含 DNA 酶 / RNA 酶。

交联过度：甲醛浓度过高或交联时间过长，DNA - 蛋白质交联难以逆转。

优化超声参数：采用脉冲式超声（如开 5 秒，停 10 秒），降低功率（150-200 W），分多次短时间处理；超声前取少量样本检测片段大小，调整至 200-500 bp 区间。

防核酸酶污染：所有器材经 DEPC 水处理或高压灭菌，试剂中添加核酸酶抑制剂（如 RNase Inhibitor）；操作时戴手套，避免手汗中的核酸酶污染样本。

控制交联程度：交联时间不超过 20 分钟，甲醛浓度不超过 2%，必要时用甲醇固定细胞（适用于易交联蛋白）；逆转交联时 65℃孵育 4-6 小时，或添加 NaCl（终浓度 200 mM）促进交联逆转。

样本间重复性差

细胞数量不一致：不同样本细胞数差异超过 20%，导致蛋白量不均一。

操作误差：抗体孵育、洗涤或 DNA 提取步骤时间控制不一致。

试剂批次差异：抗体、磁珠或缓冲液批次不同，性能不稳定。

标准化细胞处理：用台盼蓝染色计数活细胞，每样本使用相同数量细胞（如 10⁷ cells）；处理贴壁细胞时用胰酶消化后重悬，避免机械刮擦导致细胞损伤。

规范实验操作：制定详细操作时间表，确保各步骤孵育时间一致（如抗体孵育 16 小时，洗涤每次 5 分钟）；磁珠分离时使用磁力架固定时间（如 5 分钟），避免手动倾倒导致损失。

统一试剂批次：抗体和磁珠购买同一批次，分装保存（4℃或 - 20℃），避免反复冻融；缓冲液提前配制并分装，使用前平衡至室温。

qPCR 结果异常（如 Ct 值过高或无扩增）

DNA 模板量不足：ChIP 富集效率低，或 DNA 提取过程中损失。

引物二聚体或污染：引物设计导致非特异性扩增，或体系被外源 DNA 污染。

逆转交联不彻底：DNA - 蛋白质交联未完全打开，抑制 PCR。

增加模板量：浓缩 ChIP DNA（如乙醇沉淀），或增加 qPCR 反应中模板体积（不超过体系的 1/10）；确保 Input DNA 稀释度一致（如 1:100），作为阳性对照。

优化引物设计：使用 Primer3 等工具设计引物，避免 GC 含量过高（<60%）或发卡结构，Tm 值控制在 58-62℃；用蒸馏水做阴性对照，检测是否存在试剂污染。

彻底逆转交联：逆转交联时加入 NaCl（终浓度 500 mM）和 RNase A（100 μg/mL），65℃孵育过夜；必要时添加 Proteinase K（200 μg/mL）消化蛋白质，确保 DNA 完全释放。

ChIP-seq 数据质量低（如峰不明显）

抗体富集效率低：目标蛋白在基因组上结合位点少，或抗体识别表位被交联掩盖。

测序深度不足：文库测序数据量不够（如 < 1000 万 reads），无法检测低丰度结合位点。

背景噪声高：IgG 对照信号强，掩盖真实结合信号。

验证结合位点：先用 ChIP-qPCR 验证已知结合位点（如启动子区域），确认实验体系有效性；若目标蛋白为转录因子，可参考 ENCODE 数据库预测结合位点，缩小检测范围。

增加测序数据量：提高测序深度至 1500 万 - 2000 万 reads，或使用高灵敏度测序试剂盒（如 Nugen Ovation）；对 ChIP DNA 进行两轮 PCR 扩增，提高文库浓度（但需控制循环数≤18 次，避免偏差）。

优化数据处理：使用 MACS2 等软件分析数据时，提高峰识别阈值（如 q-value < 0.01），过滤低质量峰；对比 Input 样本扣除背景，或使用多个 IgG 对照平均化背景信号。

特殊样本处理问题（如原代细胞、组织）

组织解离不充分：细胞未完全分散，导致交联和超声不均匀。

细胞异质性：组织中目标细胞比例低，蛋白丰度不足。

样本量不足：原代细胞培养数量有限，难以获得足够染色质。

优化组织处理：新鲜组织用剪刀剪碎后，加入胶原酶 / 胰酶混合液 37℃消化 30-60 分钟，过筛获得单细胞悬液；解离后用 PBS 洗去消化酶，避免酶残留降解蛋白质。

富集目标细胞：通过流式细胞术（FACS）或磁珠分选（MACS）纯化目标细胞群（如 CD4+ T 细胞）；若目标细胞比例低，可增加组织用量（如 500 mg 组织对应 10⁷ cells）。

调整实验体系：原代细胞 ChIP 可减少细胞用量至 5×10⁶ cells，增加抗体浓度（如 10 μg/5×10⁶ cells）；组织样本超声时降低功率（100-150 W），延长脉冲间隔，避免细胞碎片堵塞超声探头。