科研指南 | 线粒体膜电位JC-1实验：从原理到数据分析的全流程详解

线粒体，作为细胞的“能量工厂”，其核心功能是通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）。这一过程的驱动力来源于线粒体内膜两侧的电化学梯度，即线粒体膜电位（ΔΨm）。ΔΨm是评估线粒体功能健康与否的关键指标，通常为-150mV至-180mV（内部为负）。

ΔΨm的崩塌是细胞凋亡（程序性细胞死亡）最早发生的标志性事件之一。当细胞受到凋亡信号（如药物、辐射、生长因子剥夺等）刺激时，线粒体外膜通透性增加，导致膜电位下降，这一过程称为“线粒体去极化”。随后，细胞色素C等凋亡因子从线粒体释放，激活Caspase蛋白酶级联反应，最终导致细胞凋亡。

因此，准确、灵敏地检测ΔΨm的变化，对于研究细胞凋亡机制、药物筛选、毒性评估以及神经退行性疾病、癌症等领域至关重要。

✦ JC-1实验原理

为何它是理想探针？

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JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide）是一种“比率型”荧光探针，其独特优势在于能根据膜电位高低以不同形式存在，并发出不同颜色的荧光，从而实现定性和定量分析。

工作原理详解：

高膜电位（健康线粒体）：

在ΔΨm较高的健康细胞中，带正电荷的JC-1探针被负电性的线粒体基质强烈吸引，并在线粒体内富集。
当浓度达到一定阈值时，JC-1分子发生聚集，形成“J-聚集体”（J-aggregates）。
J-聚集体在激发光（通常为488nm或514nm）照射下，发射出明亮的红色荧光，最大发射波长为590 nm。

低膜电位（不健康或凋亡早期线粒体）：

当线粒体受损、膜电位下降时，JC-1无法在线粒体内有效富集。
此时，JC-1以单体（Monomer）形式分散在细胞质中。
单体在相同激发光照射下，发射出绿色荧光，最大发射波长为529 nm。

图：细胞经过药物不同时间点处理后，凋亡细胞逐渐增多，从原先的红光多聚体，慢慢的释放为绿光单体。

图片来源：

Journal of Translational Medicine 2011, 9:45

核心优势：比率测量

JC-1检测的不是绝对荧光强度，而是红色荧光与绿色荧光的比率（Red/Green Ratio）。这种比率测量方式可以：

有效抵消因细胞数量、探针加载效率、探针淬灭等因素引起的误差，使结果更可靠。
直观反映群体细胞中膜电位发生变化的细胞比例。
颜色变化（红→绿）在荧光显微镜下非常直观，便于定性观察。

✦ JC-1应用场景

你的研究用上了吗？

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细胞凋亡研究

作为细胞早期凋亡的金标准检测方法之一，用于鉴定凋亡诱导剂或抑制剂的作用。

药物筛选与毒性评估

在药物研发中，用于评估候选化合物对线粒体的潜在毒性（线粒体毒性是药物肝毒性和心脏毒性的常见原因）。

疾病机制研究

用于研究神经退行性疾病（如阿尔茨海默症、帕金森病）、心血管疾病、癌症及代谢性疾病中线粒体功能障碍的作用。

细胞代谢状态评估

反映细胞能量代谢水平，常用于肿瘤细胞代谢、干细胞分化等研究。

✦ JC-1实验步骤

流式细胞术检测

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实验前准备

JC-1染色工作液（按试剂盒说明书配制，通常用无血清培养基或1×缓冲液稀释）

1× Assay Buffer（染色缓冲液，用于洗涤）

阳性对照：线粒体解偶联剂，如CCCP（50-100 μM终浓度），它可消耗膜电位，作为绿色荧光（单体）的对照。

流式细胞仪（激发光为蓝光488nm，检测FITC通道（绿色）和PE通道（红色））

详细步骤

1. 细胞制备与处理

用胰酶（含EDTA）消化贴壁细胞，严格控制消化时间，避免过度消化损伤细胞膜和线粒体。及时用含血清的培养基终止消化。

收集细胞悬液（包括悬浮细胞），500 g离心5分钟，弃上清。

用预冷的PBS轻柔重悬并洗涤细胞一次，再次离心弃上清。

2. JC-1染色

用1 mL预先温育至37℃的JC-1工作液重悬细胞沉淀，确保细胞密度在1×10^6/mL左右。

设置对照管：

实验组：只加JC-1工作液。
阳性对照组：在JC-1工作液中加入CCCP（例如1μL 1mM储液），37℃预孵育10-20分钟后再加入细胞，或与JC-1同时加入。

将各管细胞悬液在37℃避光孵育15-30分钟。

3. 洗涤与重悬

孵育结束后，500 g离心5分钟，小心弃去上清。

用预冷的1× Assay Buffer或PBS重悬细胞，洗涤1-2次，以去除背景荧光。

最后，用200-500 μL PBS重悬细胞，立即上机检测。

4. 上机检测

使用流式细胞仪，用488 nm激光激发。

绿色荧光（单体）通常在FITC通道（约530/30 nm）检测。

红色荧光（聚合物）通常在PE通道（约585/42 nm）检测。

✦ 结果分析与解读

JC-1实验流式检测

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1. 流式细胞术结果分析

设门策略：首先圈出活细胞群体（FSC/SSC），排除碎片和死细胞。

二维散点图：最常用的分析方式是绘制FITC（绿色） vs PE（红色）的散点图。

左下象限（双阴性）：未染色或死细胞/碎片。
右下象限（PE阳性，FITC阴性）：健康细胞，线粒体膜电位高，红色荧光强。
右上象限（双阳性）：处于中间状态的细胞，可能部分线粒体去极化。
左上象限（FITC阳性，PE阴性）：凋亡细胞，线粒体膜电位低，绿色荧光强。

关键指标：红/绿荧光强度比值（Red/Green Ratio）

流式细胞仪软件可以直接计算群体细胞的平均红绿荧光比值。

实验组比值 / 对照组比值：若该值显著降低，则表明群体细胞的平均线粒体膜电位下降，细胞处于凋亡早期。

统计学分析：通过比较不同处理组之间的红绿荧光比值，进行显著性分析。

2. 荧光显微镜结果观察

正常细胞：线粒体呈亮红色或橙红色点状/线状结构，绿色荧光很弱。

早期凋亡细胞：同一视野下，红色荧光减弱甚至消失，绿色荧光显著增强。细胞可能从红色变为橙色，最终变为绿色。

注意事项与优化技巧

探针加载：JC-1的加载浓度和时间需预实验优化，浓度过高或时间过长可能导致非特异性染色。

严格控制对照：阳性对照（CCCP）必须有效，即能使红色荧光几乎完全转变为绿色荧光。未经JC-1染色的细胞用于调节电压和补偿。

避免多色荧光干扰：若进行多色分析，需注意JC-1的红色荧光可能溢出到其他通道，需仔细进行荧光补偿。

及时检测：染色完成后应尽快上机，避免荧光淬灭或探针重新分布。

数据解读：红绿比值的下降是趋势性指标，应结合其他凋亡检测方法（如Annexin V/PI）进行综合判断。

线粒体膜电位检测是评估细胞健康与凋亡的关键窗口，其变化是细胞命运抉择的早期标志。通过JC-1等探针，我们能在药物研发、毒性评估及神经退行性疾病研究中直观捕捉细胞能量的衰竭。未来，随着多色荧光技术与活细胞动态成像的进步，该技术将更精准地揭示代谢与疾病机制的动态关联，推动精准医学发展。

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