间充质干细胞（MSCs）研究与操作指南

间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，最初于1968年由德国科学家Frieden Stein在骨髓中发现。它们来源于胚胎发育早期的中胚层，并非只存在于骨髓中，后续研究陆续在脂肪、脐带、牙髓等多种组织中分离出了MSC。

MSCs的多向分化潜能中，最基本和核心的是三系分化能力，即成骨分化、成脂分化和成软骨分化。这是鉴定MSCs的关键功能学实验。

以下是三系分化的示意图，展示了MSCs的多向分化潜能：

💠 成骨分化 (Osteogenic Differentiation)

成骨分化是指MSCs分化为成骨细胞并最终形成矿化骨组织的过程。

过程：MSCs在刺激因子和激素作用下，先定向分化为骨原细胞，进而分化为成骨前体细胞（快速增殖），随后细胞增殖能力下降，开始合成和分泌细胞外基质（主要含I型胶原，特征物是碱性磷酸酶ALP），最后成熟的成骨细胞表达骨钙蛋白和骨桥蛋白，钙盐沉积，形成矿化结节。

标志物与鉴定方法：

• 碱性磷酸酶 (ALP)：早期标志。ALP经固蓝染色呈蓝色，可通过观察颜色、统计染色阳性细胞百分比或测吸光度来鉴定。

• 钙结节 (Mineralized Nodules)：晚期标志。钙结节可被茜素红染成深红色，通过着色面积和深浅判断成骨分化强弱。

• 成骨特征基因：如ALP、Runx2等，可通过qPCR检测其表达水平。

💠 成脂分化 (Adipogenic Differentiation)

成脂分化是指MSCs分化为脂肪细胞的过程。

过程：MSCs先分化为脂肪前体细胞，在特定刺激因子（如C/EBPs和PPAR-γ）影响下，最终分化为脂肪细胞，胞浆内出现脂滴。

标志物与鉴定方法：

• 脂滴 (Lipid Droplets)：关键形态标志。脂滴可被油红O染成红色，通过统计呈红色的细胞百分比来评估成脂分化效率。

• 成脂特征基因：如LPL、PPARγ等，可通过qPCR检测。

💠 成软骨分化 (Chondrogenic Differentiation)

成软骨分化是指MSCs分化为软骨细胞的过程。

过程：MSCs先聚集成团，中间的细胞分化为成软骨细胞，进而产生大量基质和纤维（主要是II型胶原蛋白），最终被分隔在软骨陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。

标志物与鉴定方法：

• II型胶原蛋白 (Collagen Type II)：软骨特异性标志。可通过免疫组化、Western Blot检测蛋白表达，或通过qPCR检测其mRNA表达。

• 酸性粘多糖：可被甲苯胺蓝染色，也是软骨基质的重要成分。

💠 分离方法

MSCs可从多种组织中分离，常见来源包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘等。分离方法多样，需根据组织来源选择。

经典分离方法：

• 密度梯度离心法：常用Percoll分离液或Ficoll分离液。利用不同细胞密度差异进行分离，可从骨髓单核细胞中富集MSCs。

• 全血细胞培养法（贴壁筛选法）：利用MSCs在培养瓶中贴壁生长的特性，通过定期换液去除未贴壁的细胞，从而获得MSCs。此法简单实用，但耗时较长。

• 酶消化法：适用于脂肪等软组织。常用胶原酶（如0.1% II型胶原酶）消化分解细胞外基质，释放MSCs，再通过离心收集。

• 特殊装置分离：也有研究研制间充质干细胞过滤分离器，用于从胎盘、羊膜、脐带等组织中批量高效分离MSCs。

💠 传代扩增

原代分离的MSCs数量有限，需在体外进行扩增才能满足研究和应用需求。

培养基的选择：

• 传统培养基：DMEM（低糖） 或 α-MEM，添加10%胎牛血清（FBS），但血清成分存在批间差异和潜在风险。

• 无血清/无异种成分培养基：如StemPro MSC SFM XenoFree，成分明确，稳定性高，排除了动物源成分带来的风险，更符合临床应用要求。此类培养基常需配合特定的包被基质（如CTS CELLstart）使用。

扩增操作要点：

• 接种密度：通常以 5×10³ to 1×10⁴ cells/cm² 的密度接种。

• 传代时机：待细胞融合度达80%-90% 时进行传代。

• 消化酶：常用 TrypLE™ Select 或胰蛋白酶进行消化，但需注意消化时间和浓度，避免损伤细胞。

• 传代限制：值得注意的是，MSCs的增殖和能力并非无限。随着传代次数增加，其增殖能力、成骨分化能力等均可能下降。一般建议在8代以前的细胞用于实验或临床应用。

如何判定扩增后的细胞就是目的细胞——MSCs呢？必须通过一套组合鉴定方法来确定，主要包括以下三个方面：

💠 形态学观察

典型的MSCs在倒置显微镜下呈长梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观。

细胞排列在密度较低时分散分布，密度较高时可呈涡旋状或放射状生长。

💠 表面标志物检测（流式细胞术）

这是鉴定MSCs的关键依据。国际细胞治疗学会（ISCT）曾提出标准，MSCs通常：

• 阳性表达（≥95%）：CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166。

• 阴性表达（≤2%）：造血细胞标志如CD14, CD34, CD45；以及HLA-DR。

注：不同组织来源的MSCs其表面标志物可能略有差异

💠 多向分化潜能验证（功能学鉴定）

这是证明MSCs功能性的“金标准”。必须在体外诱导培养基的培养下，能够分化为：

• 成骨细胞（通过ALP染色、茜素红染色鉴定）

• 脂肪细胞（通过油红O染色鉴定）

• 软骨细胞（通过II型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色鉴定）

多向分化潜能验证/功能学鉴定

茜素红染色鉴定丨油红O染色鉴定丨阿利新蓝染色鉴定

只有同时满足以上三个方面的细胞，才能被确认为间充质干细胞。

尽管间充质干细胞领域前景广阔，但也面临诸多挑战：

• 生物学特性挑战：MSCs在体外扩增过程中会逐渐衰老，增殖和多向分化潜能（特别是成骨潜能）会随着传代次数的增加而下降。

• 质量控制与监管挑战：行业监管体系正在强化，标准日益严格。例如，中国自2025年起实施的《细胞治疗产品生产检查指南》确立了“先证后批”原则，对GMP车间、质量管理体系和全流程追溯提出了更高要求。

• 疗效评价挑战：疗效评价标准正从主观感受改善转向要求客观指标的显著变化（如LVEF、FEV1、WOMAC评分等）。

间充质干细胞未来发展趋势包括细胞来源多元化（如气道干细胞、牙髓干细胞等以期提升治疗精准性），以及监管体系的不断完善和支付体系的逐步探索（医保、商保）。

希望以上内容能帮助您全面了解间充质干细胞

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